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刘丹盛军①杨贵贞 ②
(吉林大学基础医学院免疫教研室 ,长春 130021)
中国图书分类号 R392 文献标识码 A 文章编号 10002484X( 2004) 0320167204
[摘要] 目的 :研究携带 HBsAg 基因的载体质粒 pcDHBs 诱导小鼠 CTL 应答效果.方法 :将HBsAg 基因连接到真核表
达载体 pcDNA 311 上 ,构建成载体质粒 pcDHBs.将纯化后的质粒 pcDHBs 和pcDNA 311 肌肉注射免疫小鼠 ,眼眶采血检测血清
中抗体水平.用质粒 pcDHBs 转染 P815 细胞制备乙肝疫苗诱导 BALB/ C 小鼠 CTL 活性检测的靶细胞.免疫后 ,取脾细胞 ,按
效靶比为 10∶1、25∶1、50∶1 进行 CTL 杀伤检测.结果 :免疫 pcDHBs 疫苗后 ,检测到小鼠血清中的 HBsAb.用pcDHBs 进行转染
的P815 细胞能够检测到 HBsAg 基因片段和蛋白质抗原的表达.用pcDHBs 免疫组小鼠的 CTL 杀伤率均明显高于 pcDNA 311
免疫组.结论 :质粒 pcDHBs 作为核酸疫苗能够诱导小鼠体液免疫应答和 CTL 免疫应答.
[关键词] 乙肝病毒表面抗原 ;核酸疫苗 ;CTL 应答
Induction of a CTL response to hepatitis B viral nucleic acid vaccine in BALB/ C
mice
LIU Dan , SHENG Jun
①
, YANG Gui2Zhen. Department of Immunology , Basic Medical School of Jilin University ,
Changchun 130021; ①Changchun Institute of Biological Products , Changchun 130062 , China
Abstract Objective :To discuss CTL response to the hepatitis B viral nucleic acid vaccine in mice.Methods :The recombinant plas2
mid containing HBV S gene was directly injected intramusculary into BALB/ C mice. HBsAb in sera was checked with ELISA. The recombinant
plasmid was transfected P815 cells by liposome and screened by G418. Splenocytes were isolated for investigating specific CTL response. Re2
sults :HBsAb in sera of mice was tested after pcDHBs injection. HBsAg was detected in culture medium of the transfected P815 cells. Compared
mice injected with pcDNA311 ,the specific CTL cytotoxity activity of mice immunized with pcDHBs was significantly enhanced.Conclusion :
HBV nucleic acid vaccine could stimulate humoral immunity and CTL response of the mice.
Key words HBsAg;Nucleic acid vaccine ;CTL response
核酸疫苗是近年发展起来的一种新兴免疫方
法 ,是将携带目的基因的重组真核表达载体导入体
内 ,使之在细胞内持续表达具有天然构象的蛋白质
抗原 ,从而诱导机体产生抗原特异的体液和细胞免
疫应答.由于核酸疫苗可以诱导机体产生较强且持
久的 CTL 应答 ,有望用于乙型肝炎等慢性病毒感染
的治疗1
.本文构建了含有乙肝病毒 S 段基因的重
组表达载体 pcDHBs ,在获得较好的体液免疫的基础
上 ,对其诱导小鼠产生 CTL 应答的细胞免疫效果做
了进一步研究 ,为今后研制乙肝核酸疫苗提供理论
和实践依据.
1 材料与方法
111 实验动物 6 周龄雌性 BALB/ C 小鼠 ,购自长
春生物制品研究所动物室 ; 真核表达质粒 pcDNA
3 11和含有 HBsAg基因的质粒pTHBs由本室保存 ;
①长春生物制品研究所 ,长春 130062
②通讯作者
作者简介 :刘丹(1975 年-),女 ,免疫学专业博士生.
CytoTox 96R
Non2Radioactive Cytotoxicity Assay 试剂盒
购自 Promega 公司 ; HBsAb 检测试剂盒购自北京万
泰试剂公司 ;HBsAg 检测试剂盒购自华美试剂公司 ;
引物及测序由上海生物工程公司完成 ;TaqDNA 聚合
酶购自 Promega 公司 ;各种限制性内切酶均购自大
连宝生物公司 ;ConA 购自 Sigma 公司 ; IMDM 培养基
购自 Gibco 公司.
112 重组质粒 pcDHBs 的构建 将质粒 pTHBs 和pcDNA 311 用Xho Ⅰ/ Kpn Ⅰ酶切消化后 ,进行载体和
目的基因的连接 ,转化大肠杆菌 XL2IBlue 感受态细
胞 ,在 Amp 抗性平板上挑取单菌落 ,过夜培养后提
取质粒 ,得到重组质粒 pcDHBs.
113 质粒 pcDHBs 的大量提取和纯化 大量提取质
粒的方法参照《分子克隆实验指南》,以Sepharose2CL
4B 柱层析纯化质粒 ,分光光度计检测 OD260 进行核
酸定量 ,计算 OD260 和OD280 比值检测核酸纯度.
114 免疫小鼠 取6周龄雌性 BALB/ C 小鼠 ,肌肉
注射质粒 pcDHBs 200μg/ 只 ,分别于第 2 周和第 4 周
加强免疫一次.同时设对照组 , 注射质粒 pcDNA
311 ,剂量、途径同实验组.
·761·刘 丹等 乙肝核酸疫苗诱导 BALB/ C 小鼠的 CTL 免疫应答 第3期115 免疫小鼠血清中 HBsAb 的检测 加强免疫后
每周眼眶采血一次 ,分离血清 ,应用 ELISA 方法检测
其HBsAb 水平.
116 特异性 CTL 效应测定
11611 靶细胞的制备 将生长状态良好的 P815 细
胞按 1 *105
/ 孔的密度转移至六孔板中 ,在37 ℃、5 %
CO2 ,5 %小牛血清的 IMDM 培养基中培养至 50 %贴
壁生长.将2mg/ ml 的LipofectAMINETM
10 μl 与无
血清和抗生素的 IMDM 培养基 100μl 混合 ,室温静
置45 分钟后 ,与含有 2μg 质粒 pcDHBs 的100μl 无
血清和抗生素的 IMDM 培养基混合 ,室温静置 15 分
钟后 ,加入相应培养板中 ,补充 2 ml 无血清和抗生
素的 IMDM 培养基 ,37 ℃、5 %CO2 培养 10 小时后 ,加入5%小牛血清的 IMDM 培养基继续培养 48 小时.
用含有 500 μg/ ml G418 的完全培养基筛选转染细
胞 ,两周后将 G418 浓度降至 100μg/ ml .
11612 靶细胞的 DNA 提取及 PCR 鉴定 将1*107
的G418 筛选的转染细胞转移至三角瓶中 ,加入 10
ml 抽提缓冲液(10 mmol/ L Tris·Cl ,011 mol/ L EDTA ,
20μg/ ml 胰RNA 酶,015 % SDS) ,37 ℃温育 1 小时 ,
加入蛋白酶 K至终浓度为 100μg/ ml ,置于 50 ℃水浴
中3小时.酚抽提 2 次 ,转移水相 ,加入 012 体积的
10 mol/ L 乙酸铵和 2 倍体积的乙醇 ,离心收集沉淀 ,
加入 500μl TE 重悬.取2μl 重悬的转染细胞 DNA
作为模板 , P1 : 5′2 ACTCGAGACATGGAGAACACAG 2
3′、P2 : 5′2 AGGTACCTCAAATGTATACCCA 2 3′为引
物进行 PCR 扩增 HBsAg 基因片段.
11613 检测靶细胞上清中的 HBsAg 表达 转染后
48 小时取细胞上清液 50μl ,应用 ELISA 方法检测其
HBsAg 表达情况 ,具体方法见试剂盒检测说明书.
11614 效应细胞的制备 第3次免疫后 4 周 ,无菌
取小鼠脾脏 ,浸泡于 3 ml IMDM 培养基中 ,研磨成细
胞悬液 ,离心后加入 4 ml 红细胞裂解液 ,再度离心 ,
加入含 5 %小牛血清的 IMDM 培养基调整细胞密度
为1*107
ml – 1
,取3ml 加入 6 孔细胞培养板.加入
100μl HBsAg 使其终浓度为 10 μg/ ml ,加入 100 μl
IL22 使其终浓度为 25 U/ ml .37 ℃、5 %CO2 培养 5
天.
11615 乳酸脱氢酶 (LDH) 法测定特异性 CTL 效应
取96 孔圆底细胞培养板 ,每孔加入 100μl 1 *105
ml – 1
的靶细胞 ,按效靶比为 50∶1、25∶1、10∶1 加入
100μl 效应细胞.同时设效应细胞自发LDH 释放对
照孔、靶细胞自发 LDH 释放对照孔、靶细胞最大
LDH 释放对照孔、培养基及裂解液背景对照孔.
37 ℃培养 4 小时.加裂解液 (10 *) 到靶细胞最大
LDH 释放对照孔 ,作用 45 分钟.每孔转移 50μl 上
清到平底的酶分析板.用12 ml 室温的分析缓冲液
重悬底物混合物 ,向酶分析板中每孔加入 50μl 重悬
的底物混合物 ,盖上板 ,避光 ,室温作用 30 分钟 ,每
孔加入 50μl 终止液.1 小时内 ,记录 490 nm 的吸收
值.详见 CytoTox 96R Non2Radioactive Cytotoxicity As2
say 试剂盒使用说明书.
2 结果
211 重组质粒 pcDHBs 的鉴定 将重组质粒 pcD2
HBs 用Xho Ⅰ/ Kpn Ⅰ限制性内切酶消化后 ,得到 515
kb 和700 bp 左右 2 个基因片段 ,与理论计算大小相
符.目的基因片段的序列测定结果与已知序列一
致.见图 1.
212 质粒 pcDHBs 的纯化及定量 大量提取的质粒
pcDHBs 经Sepharose2CL 4B 柱层析纯化后,收集DNA ,乙醇沉淀后 , 重悬质粒.分光光度计检测
OD260 和OD280 ,计算 OD260/ OD280 比值为 11776 ,
说明质粒纯度较好 ;每升菌体收获约 5126 mg 质粒
DNA.
213 靶细胞的 DNA 提取及 PCR 鉴定 以转染细胞
的DNA 为模板 ,PCR 扩增 HBsAg 基因片段 ,得到大
小约 700 bp 的扩增产物 ,与理论计算大小相符.见图2、图3.
214 ELISA 方法检测靶细胞上清中的 HBsAg 表达
应用 ELISA 方法检测到转染 48 小时后靶细胞上
清中有 HBsAg 表达 ,未转染的 P815 细胞没有检测到
HBsAg 表达.
215 免疫小鼠血清中 HBsAb 测定 加强免疫后每
周眼眶采血一次 ,分离血清 ,应用 ELISA 方法根据标
准品进行定量检测 HBsAb 水平.结果显示 ,pcDHBs
图1质粒 pcDHBs 的鉴定
Fig. 1 Restriction map of plasmid pcDHBs
Note :Lane 1. molecular weight marker (λDNA/ Hind Ⅲdigest) ; Lane 2. re2
combinant plasmid pcDHBs digested with Xho Ⅰand Kpn Ⅰ; Lane 3.
plasmid pcDNA311 digested with Xho Ⅰand Kpn Ⅰ; Lane 4. PCR
product.
·861· 中国免疫学杂志 2004 年第 20 卷图2靶细胞的染色体 DNA
Fig. 2 Electrophoresis analysis of chromosome DNA from tar2
get cell
Note :Lane 1. chromosome DNA from target cell ; Lane 2. molecular weight
marker (λDNA/ Hind Ⅲdigest) .
图3靶细胞 DNA 的PCR鉴定
Fig. 3 Identification of PCR product
Note :Lane 1. PCR product ; Lane 2. molecular weight marker (DL22000) .
图4小鼠血清 HBsAg 水平测定
Fig. 4 Assay HBsAb in sera of mice
图5免疫小鼠 CTL 效应测定
Fig. 5 CTL activity of the immune mice
免疫组血清中 HBsAb 水平从第 1 周开始持续升高 ,
至第 4 周达到 13710 mU/ ml ,pcDNA 311 免疫组血清
中始终没有检测到 HBsAb ,见图 4.
216 CTL 活性检测 按公式计算杀伤百分率 :CTL 活性(%) =
(实验孔 – 效应细胞自发释放孔 – 靶细胞自发释放孔)
(靶细胞最大释放孔 – 靶细胞自发释放孔)
*
100 %.结果显示 ,效靶比为 10∶1、25∶1、50∶1 时,pcD2
HBs 免疫组的杀伤百分率分别为 31122 %、40123 %、
44169 % ,pcDNA311 免疫组的杀伤百分率分别为
11124 %、13135 %、14137 %.pcDHBs 免疫组的 CTL
活性均明显高于 pcDNA 311 免疫组 ,见图 5.
3 讨论
在多种病毒性疾病的动物模型上已经证实核酸
疫苗可以诱导产生体液和细胞介导的免疫反应 ,这
些反应是具有保护性的.质粒 DNA 被导入细胞后 ,
抗原编码基因在质粒的强启动子作用下表达蛋白质
抗原 ,随后被降解成 8~12 个氨基酸的短肽 ,这些短
肽带有不同的抗原表位 ,分别与 MHC Ⅰ类和 MHC Ⅱ
类分子结合并被提呈到细胞表面 ,与MHC Ⅰ类分子
结合的短肽激活 CD8 +
T 细胞 (CTL) ,与MHC Ⅱ类分
子结合的短肽激活 CD4 +
T 细胞 ,而分泌到细胞外的
抗原则被表达相应抗体的 B 细胞捕捉 ,并在 T 辅助
细胞分泌淋巴因子的刺激下转化为浆细胞 ,大量分
泌抗体2
.这种抗原在细胞内的表达与病毒自然感
染过程中抗原的表达一致 ,能够使抗原以天然形式
被加工后提呈给免疫识别系统.其中 ,CTL 的激活
及对靶细胞的杀灭是疫苗保护作用的体现 ,为抵抗
病毒攻击的最主要机制.由核酸疫苗产生的蛋白质
抗原可以通过 MHC Ⅰ类分子进入抗原提呈途径 ,通
常亚单位疫苗或灭活的病毒疫苗不具有这种抗原提
呈机制 ,因而 ,核酸疫苗可被用来代替危险性大的减
毒活疫苗3
.
近年来发现 ,用于细菌免疫的质粒 DNA 本身也
是一种免疫佐剂4
,可有效地激活多种免疫效应细
胞 ,介导这一作用的是一类含 CpG基元的具有免疫
激活作用的六碱基 DNA 顺序 ,被称为免疫刺激 DNA
序列(ISS) ,是一种回纹结构的非甲基化的 CpG为核
心的序列.在DNA 疫苗载体质粒中增加 CpG序列
可以增强抗体水平和 CTL 应答.目前 ,已有的数据
表明亚单位或灭活病毒疫苗主要诱发产生高滴度中
和抗体 ,但细胞免疫不显著.本研究室将 ISS 与传
统疫苗共同作用免疫小鼠不仅可以显著增强血清中
Ab 水平 ,而且可激发特异性 CTL 免疫应答5
.实验
证实 ,含ISS 的DNA 佐剂可作用于核酸疫苗也可作
用于蛋白质疫苗.由于核酸疫苗质粒本身可携带
·961·刘 丹等 乙肝核酸疫苗诱导 BALB/ C 小鼠的 CTL 免疫应答 第3期ISS 序列 ,无须另外合成、添加 ,比蛋白质疫苗具有更
大的优越性.乙型肝炎是严重威胁人类健康的世界
性传染病 ,虽然基因工程乙肝疫苗已广泛应用 ,但存
在免疫次数多、有效免疫时间不够长等缺点.目前 ,
对慢性乙肝病人的治疗尚无有效手段.研究结果显
示乙肝核酸疫苗不仅具有免

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