医疗，健康，保健，疾病，ppt文档知识

基因工程基 因工程华东理工大学 张惠展华东理工大学 张惠展
基因工程
5
2
3
4
1
6
7
8
9
重组DNA技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本概念
重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术与基因工程的基本原理
重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术所需的基本条件
重组DNA技术的操作过程重组DNA技术的操作过程
目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建
外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达
外源基因在酵母菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达
外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达
外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化
E 酵母菌的表达系统E 酵母菌的表达系统
7 外源基因在酵母菌中的表达7 外源基因在酵母菌中的表达
C 酵母菌的载体系统C 酵母菌的载体系统
B 酵母菌的宿主系统B 酵母菌的宿主系统
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
F 利用重组酵母生产乙肝疫苗F 利用重组酵母生产乙肝疫苗
D 酵母菌的转化系统D 酵母菌的转化系统
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
7 外源基因在酵母菌中的表达7 外源基因在酵母菌中的表达
酵母菌的分类学特征酵母菌的分类学特征
酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细酵母菌(Yeast)是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细
胞真核生物,分属于子囊菌纲(子囊酵母菌)、担子菌纲(担子酵母胞真核生物,分属于子囊菌纲(子囊酵母菌)、担子菌纲(担子酵母
菌)、半知菌类(半知酵母菌),共由56个属和500多个种组成.如菌)、半知菌类(半知酵母菌),共由56个属和500多个种组成.如
果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统,则酵母菌是最果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统,则酵母菌是最
成熟的真核生物表达系统.成熟的真核生物表达系统.
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征
7 外源基因在酵母菌中的表达7 外源基因在酵母菌中的表达
酵母菌表达外源基因的优势酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序,基因表达调控机理比较清楚,遗传操作简便全基因组测序,基因表达调控机理比较清楚,遗传操作简便
能将外源基因表达产物分泌至培养基中能将外源基因表达产物分泌至培养基中
具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
不含有特异性的病毒、不产内毒素,美国FDA认定为安全的不含有特异性的病毒、不产内毒素,美国FDA认定为安全的
基因工程受体系统(Generally Recognized As Safe GRAS)基因工程受体系统(Generally Recognized As Safe GRAS)
酵母菌是最简单的真核模式生物酵母菌是最简单的真核模式生物
B 酵母菌的宿主系统B 酵母菌的宿主系统
7 外源基因在酵母菌中的表达7 外源基因在酵母菌中的表达
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括:目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括:
酵母属 如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母属 如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)
毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)
汉逊酵母属 如多态汉逊酵母(Hansenula polymorpha)汉逊酵母属 如多态汉逊酵母(Hansenula polymorpha)
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽,但巴斯德毕赤酵母其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽,但巴斯德毕赤酵母
表达外源基因最理想.表达外源基因最理想.
提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型
ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工
rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平
ose1 提高重组蛋白表达 转录水平ose1 提高重组蛋白表达 转录水平
ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Yssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Y
rho- 提高重组蛋白表达 转录水平rho- 提高重组蛋白表达 转录水平
突变类型突变类型 生物效应生物效应 作用位点作用位点
抑制超糖基化作用的突变宿主菌抑制超糖基化作用的突变宿主菌
能抑制超糖基化的突变类型能抑制超糖基化的突变类型
mnn 甘露糖生物合成缺陷型mnn 甘露糖生物合成缺陷型
alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型
och 外侧糖链添加缺陷型och 外侧糖链添加缺陷型
突变类型突变类型 生物效应生物效应
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团,许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团,
它们常常影响蛋白质的生物活性.整个糖单位由糖基核心和外侧糖它们常常影响蛋白质的生物活性.整个糖单位由糖基核心和外侧糖
链两部分组成.链两部分组成.
酵母菌普遍拥有蛋白酵母菌普遍拥有蛋白
质的糖基化系统,但野生质的糖基化系统,但野生
型酿酒酵母对异源蛋白的型酿酒酵母对异源蛋白的
糖基化反应很难控制,呈糖基化反应很难控制,呈
超糖基化倾向,因此超糖超糖基化倾向,因此超糖
基化缺陷株非常重要.基化缺陷株非常重要.
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用泛素介导的蛋白质降解作用
蛋白酶体蛋白酶体
LysLys HOOC Ubiquitin 76 aaUbiquitin 76 aa
ubiquitin ligase E3ubiquitin ligase E3
LysLys
ubiquitin ligase E3ubiquitin ligase E3
LysLys
靶蛋白
靶蛋白
靶蛋白
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因:酵母菌共有四个泛素编码基因:
UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52(CEP52) 对数生长期表达 稳定期关闭UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52(CEP52) 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52(CEP52) 对数生长期表达 稳定期关闭UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52(CEP52) 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76(CEP76) 对数生长期表达 稳定期关闭UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76(CEP76) 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌共有七个泛素连接酶基因:酵母菌共有七个泛素连接酶基因:
UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7UBC 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7
减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素降解途径衰减的酿酒酵母泛素降解途径衰减的酿酒酵母
在酿酒酵母菌中,泛素主要由UBI 4基因表达,UBI 4-突变株能在酿酒酵母菌中,泛素主要由UBI 4基因表达,UBI 4-突变株能
UBI 4缺陷型:UBI 4缺陷型:
正常生长,但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多,正常生长,但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多,
因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体
UBA 1缺陷型:UBA 1缺陷型:
UBA1编码泛素激活酶E1,UBA1突变株是致死性的,但其等位UBA1编码泛素激活酶E1,UBA1突变株是致死性的,但其等位
基因缺陷是非致死性的,而且也能削弱泛素介导的蛋白降解基因缺陷是非致死性的,而且也能削弱泛素介导的蛋白降解
Ubc4 – ubc5 双突变型:Ubc4 – ubc5 双突变型:
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
C 酵母菌的载体系统C 酵母菌的载体系统
7 外源基因在酵母菌中的表达7 外源基因在酵母菌中的表达
酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌中的野生型质粒酵母菌中的野生型质粒
酵母菌中的野生型质粒酵母菌中的野生型质粒
酿酒酵母中的2μ环状质粒酿酒酵母中的2μ环状质粒
几乎所有的酿酒酵母中都含有2μ双链几乎所有的酿酒酵母中都含有2μ双链
同源重组同源重组
REP1REP1
RAFRAF
STBSTB
oriori
REP2REP2
FLPFLP
IRIR
IRIR
AA
BB
环状质粒,拷贝数达50至100个.环状质粒,拷贝数达50至100个.
IRs 反向重复序列,600 bp,重组IRs 反向重复序列,600 bp,重组
FLP 编码产物驱动IRs的同源重组FLP 编码产物驱动IRs的同源重组
REP 编码产物控制质粒的稳定性REP 编码产物控制质粒的稳定性
STB REP的结合位点STB REP的结合位点
接合酵母属中的pSR1和pSB1,以及接合酵母属中的pSR1和pSB1,以及
克鲁维酵母属中的pKD1等均与2μ质克鲁维酵母属中的pKD1等均与2μ质
粒类似.粒类似.
酵母菌中的野生型质粒酵母菌中的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线状质粒乳酸克鲁维酵母中的线状质粒
乳酸克鲁维酵母中含有两种不同乳酸克鲁维酵母中含有两种不同
pGKL1 8.9 kbpGKL1 8.9 kb
DNA聚合酶 毒素蛋白αβ 免疫蛋白 γ 亚基DNA聚合酶 毒素蛋白αβ 免疫蛋白 γ 亚基
的双链线状质粒pGKL1和pGKL1的双链线状质粒pGKL1和pGKL1
拷贝数为50-100个,分别携带K1拷贝数为50-100个,分别携带K1
K2两种能使多种酵母菌致死的毒K2两种能使多种酵母菌致死的毒
反向重复序列反向重复序列
素蛋白编码基因(α β γ),同时含有毒素蛋白抗性基因.素蛋白编码基因(α β γ),同时含有毒素蛋白抗性基因.
酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建
含有ARS的YRp质粒的构建含有ARS的YRp质粒的构建
ARS为酵母菌中的自主复制序列,0.8-1.5kb,染色体上每30-40kbARS为酵母菌中的自主复制序列,0.8-1.5kb,染色体上每30-40kb
就有一个ARS元件.酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标就有一个ARS元件.酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标
记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA.记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA.
以ARS为复制子的质粒称为YRp以ARS为复制子的质粒称为YRp
上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个,但培养几代上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个,但培养几代
以2μ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp以2μ质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp
后,质粒的丢失率高达50%-70%,主要是由于分配不均匀所致.后,质粒的丢失率高达50%-70%,主要是由于分配不均匀所致.
酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建
含有CEN的YCp质粒的构建含有CEN的YCp质粒的构建
CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列
将CEN DNA插入含ARS的质粒中,获得的新载体称为YCp将CEN DNA插入含ARS的质粒中,获得的新载体称为YCp
YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性,但拷贝数只有1 – 5个YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性,但拷贝数只有1 – 5个
含有TEL的YAC质粒的构建含有TEL的YAC质粒的构建
酵母菌克隆表达质粒的构建酵母菌克隆表达质粒的构建
含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因,在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因,
构建出来的质粒称为Yip.目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定构建出来的质粒称为Yip.目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定
序列中

PDF文档下载